Заседание семинара "Общеинститутский семинар" 24.04.2024 в 14-00. "Компьютерный дизайн праймеров для петлевой изотермической амплификации", Лиана Ульфатовна Ахметзянова

В настоящее время все более широкое применение находит анализ биологических образцов путем обнаружения в них специфических последовательностей нуклеиновых кислот (НК) с помощью амплификации ‒ ферментативной реакции, приводящей к наработке фрагментов ДНК в количестве, которое может быть детектировано инструментальными методами. Разработано множество методов амплификации НК, различающихся вариантами проведения реакции и способами детекции ее результатов. Самым популярным методом остается полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая включает несколько этапов, протекающих при разных температурах. Из-за необходимости термоциклирования продолжительность ПЦР составляет около 1,5 ч, в связи с чем вызывают интерес более быстрые реакции амплификации, протекающие при постоянной температуре. Среди таковых наиболее популярной стала петлевая изотермическая амплификация (LAMP); LAMP-анализ занимает, как правило, до 40 мин. Незаменимым компонентом любой амплификационной системы являются праймеры ‒ короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 16-30 нуклеотидов, для подбора которых используются специализированные компьютерные программы, базирующиеся на различных алгоритмах. Некоторые программы дизайна праймеров представлены в виде бесплатных web-сервисов, их дистрибутивы могут быть скачаны с соответствующих сайтов или получены от разработчиков. Для части программ их код находится в открытом доступе, ряд программ доступен на платной основе. Для проведения классической ПЦР необходимы два праймера (прямой и обратный), для подбора которых написаны сотни различных компьютерных программ. В отличие от ПЦР, для проведения LAMP нужно как минимум четыре праймера: два внешних и два внутренних, последовательности которых гомологичны шести участкам нуклеотидной последовательности мишени. Дизайн LAMP-праймеров представляет собой более трудную задачу, при этом количество соответствующих программ не превышает десяти. Из них только две доступны онлайн, одна работает на Linux. Данные программы имеют определенные ограничения, например, позволяют осуществлять подбор праймеров только на основе нуклеотидных последовательностей, не учитывают образование димеров. Это приводит к подбору праймеров недостаточно высокого качества, следствием чего может стать получение недостоверных результатов амплификационного анализа. Таким образом, создание инструмента для дизайна «качественных» праймеров для петлевой изотермической амплификации является актуальной задачей. Целью настоящей работы является разработка комплекса программ для компьютерного моделирования праймерных систем, позволяющих подбирать специфичные праймеры для проведения петлевой изотермической амплификации.
Задачи исследования. Для достижения данной цели, были поставлены следующие задачи:
1. Смоделировать новую систему подбора праймеров для LAMP на основе
расчета температуры отжига, включающую учет длины праймеров,
возможность расположения их на максимально близком расстоянии друг от
друга и исключения потенциальных димерных структур.
2. Предложить модификацию алгоритма прямого перебора с использованием
трафаретного подхода, учитывающего GC-состав и температуру отжига
праймеров.
3. Разработать комплекс программ с дружелюбным интерфейсом и
многокритериальными условиями дизайна праймеров для LAMP. Провести
верификацию нового программного продукта. Сравнить с существующими
аналогами (NEB LAMP, PrimerExplorer).
4. Провести тестирование функционала программ на нуклеотидных
последовательностях различной структуры и экспериментальную валидацию
праймеров на примере обнаружения генетического материала коронавируса
SARS-CoV-2.

Научная новизна заключается: 1) в моделировании новой системы дизайна праймеров для петлевой изотермической амплификации, подразумевающей задание
жестких критериев отбора и возможность сближения последовательностей праймеров в пределах одного комплекта; 2) в модификации метода прямого перебора с
использованием трафаретного подхода для поиска праймеров; 3) в разработке комплекса программ с расширенным функционалом, который позволяет подбирать
специфичные праймеры для получения более точных диагностических результатов. Практическая значимость работы определяется созданием программного комплекса для моделирования (дизайна) наборов специфичных LAMP–праймеров на основе новой системы их подбора. Разработанный программный комплекс может
быть использован в молекулярной биологии, для создания диагностических тест-систем, обеспечивающих высокую чувствительность и достоверность обнаружения
специфических ДНК и РНК. Программный комплекс может применяться в научно-исследовательских институтах и лабораториях, занимающихся амплификацией
нуклеиновых кислот. Методология и методы исследования. В основе разработанного алгоритма лежит линейный поиск образца в строке с учетом критериев подбора праймеров для LAMP. Программный комплекс дизайна LAMP–праймеров реализован на языке программирования Python, с использованием библиотек bioPython для работы с
нуклеотидными последовательностями и фреймворка Qt для разработки интерфейса.

Положения, выносимые на защиту.
- Смоделирована новая система подбора праймеров для LAMP, включающая
формулу расчета температуры отжига праймеров, возможность расположения их на
максимально близком расстоянии и исключения потенциальных димерных структур.
Полученная модель позволяет предотвратить получение ложных результатов
(обеспечивает высокую специфичность амплификации).
- Предложена модификация метода прямого перебора с использованием
трафаретного подхода, учитывающего GC-состав и температуру отжига и
позволяющего снизить сложность перебора.
- Разработан программный комплекс LAMPrimers iQ для дизайна специфичных
праймеров для проведения LAMP-амплификации, позволяющий подбирать наборы
праймеров на основе нуклеотидных последовательностей различной структуры и
длины. В амплификационных экспериментах было показано, что праймеры,
подобранные с помощью программы LAMPrimers iQ, обеспечивают более высокую
специфичность анализа